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                  低溫保存

                  低溫冷凍過程對細胞的損傷主要包括冰晶損傷和溶質損傷。如果將細胞懸浮在純水中,隨著溫度的降低,細胞內外的水分都會結冰,所形成的水晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內部結冰而導致的細胞損傷稱為細胞內冰晶損傷。如果將細胞懸浮在溶液中,隨著溫度的降低,細胞外部的水分會首先結冰,從而使得未結冰的溶液中電解質濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質的溶液中且時間過長,細胞膜上脂質分子會受到損壞,細胞便發生滲漏,在復溫時,大量水分會因此進入細胞內,造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質損傷或稱溶液損傷。當溫度進一步下降,細胞內外都結冰,產生冰晶損傷。這就構成了低溫冷凍消融的直接機制。

                  為對抗這些損傷機制,對細胞進行冷凍保存,需要在冷凍保護劑、冷凍速度、復溫速度等多方面采取措施,對于不同的細胞采取不同的精確設計、各參數互相關聯的方案,以提高細胞復蘇后的存活率。

                  冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。一般來講,只有紅細胞、大多數微生物和極少數有核的哺乳動物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中,并以最合適的冷凍速度冷凍,可以獲得活的凍存物。但對于大多數有核哺乳動物細胞來說,在不加冷凍保護劑的情況下,無最適冷凍速度可言,也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中,并以0.3~600℃/min的冷凍速率降溫冷凍,98%以上的細胞會死亡;而加入甘油冷凍保護劑進行冷凍保存時,98%以上的細胞都可存活。

                  冷凍速度是指降溫的速度,直接關系到冷凍效果。不同的冷凍速度既能使細胞內發生不同的生理變化,也可以對細胞產生不同的損傷。當冷凍速度過慢時,細胞脫水嚴重,細胞體積嚴重收縮,超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢,還會引起細胞外溶液部分結冰,從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度增高,產生溶質損傷。當冷凍速度過快時,細胞內水分來不及外滲,會形成較多水晶,造成細胞膜及細胞器的破壞,產生細胞內冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細胞內外呈玻璃化凝固,無冰晶形成或形成很小的冰晶,對細胞膜和細胞器不致造成損傷,細胞也不會在高濃度的溶質中長時間暴露而受損。不同細胞的最適冷凍速度不同。人紅細胞的最適冷凍速度分別為200℃/min。對一種細胞進行冷凍保存之前,首先需要測定其最適冷凍速度,以保證獲得最高的冷凍存活率。通常保存人體細胞會將其置于含有冷凍保護液的試管中,并將試管迅速放入液氮中以期獲得高達數百℃/min的冷凍速度。

                  復溫速度是指在細胞復蘇時溫度升高的速度。復溫速度不當也會降低凍存細胞存活率。一般來說,復溫速度越快越好,此時細胞內外不會重新形成較大的冰晶,也不會暴露在高濃度的電解質溶液中過長的時間,從而無冰晶損傷和溶質損傷產生,凍存的細胞經復蘇后仍保持其正常的結構和功能。常規的做法是,在37℃水浴中,于1~2分鐘內完成復蘇。復溫速度過慢,細胞內往往重新形成較大水晶而造成細胞損傷。復溫時造成的細胞損傷非???,往往在極短的時間內發生。

                  細胞冷凍保存是一項細致而精確的工作,稍有不慎即會導致冷凍存活率的大幅度下降甚至細胞全部死亡。

                   
                   
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